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在PCR扩增实验中应注意什么
1.引物的质量是保证PCR特异性的关键，引物过长或过短均会使特异性降低，以18～30bp为宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物内部和引物之间不应含有互补序列；引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%；引物的3’末端与模板DNA一定要配对，但末端没有严格的限制，故引物设计时可在5’末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等；引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”；引物的终浓度一般为0.2～0.5μmol/L，过低会影响反应产量，过高会增加引物二聚或错配的几率。
2.TaqDNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但无3’-5’外切酶活性，因此对单核苷酸的错配无校正功能，发生碱基错配的几率为2.1×10-4左右。然而TaqDNA聚合酶的优势在于反应产量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的PfuDNA聚合酶一直是研究人员心目中最好的高保真酶，而PfuDNA聚合酶经基因工程改造后，新创出的PfuUltra具有更佳的校验活力。数据显示PfuUltraTM高保真DNA聚合酶的平均错配率为PfuDNA聚合酶的1/3，为TaqDNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/错误率)(数据来源：美国冷泉港实验室)。
3.Mg2+浓度也是影响反应效率和特异性的重要因素之一。TaqDNA聚合酶对Mg2+浓度非常敏感，Mg2+可与模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根结合，不同反应体系中应适当调整MgCl2的浓度，一般以比dNTP总浓度高出0.5～1.0mmol/L为宜，Mg2+过量能增加非特异扩增。
4.dNTP的浓度过高会增加碱基的错误掺入率，使反应特异性下降；过低则会导致反应速度下降。使用时4种dNTP必须以等当量浓度配制，均衡的dNTP有利于减少错配误差和提高使用效率。
5.温度循环参数中应特别注意复性温度，它决定引物与模板的特异性结合。退火复性温度可根据引物的长度，通过Tm＝4(G+C)+2(A+T)计算得到。在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合。
6.减低污染的常规措施：①将PCR试剂、PCR产物及其他分子生物学试剂分开放置；②应保持样品制备、PCR反应液配制与PCR产物分析三个工作区的独立性；③使用阳性和阴性对照；④使用最高质量的水配制PCR实验的所有反应试剂；⑤配制好的PCR反应试剂应分成小包装储存，每个包装仅用于单次实验；⑥制备样品、配制试剂及反应液时必须戴手套；⑦实验前一定要认真清洁加样器等。
进入实验室该做哪些防护工作
呼吸防护实验过程中，有些会发生化学反应产生有毒有害蒸气或气体，从而对工作人员造成呼吸道的伤害，这样就需要佩戴个人呼吸防护用品，比较常见的有防毒面具或防毒口罩。
具体需要按现场有毒气体的危害程度来选择，如果毒性较大，建议选择（haigu）防毒面具。眼睛及脸部防护1.防护眼罩或防化眼镜：眼睛及脸部是实验室中最易被事故所伤害的部位，因而对他们的保护尤为重要。实验室工作环境内，涉及到溶液试剂的实验人员必须戴安全防护眼镜。
2.洗眼器：当化学溶剂溅入眼睛后，应立即用使用洗眼器彻底冲洗。冲洗时，应将眼皮撑开，小心地用自来水冲洗数分钟，再用蒸馏水冲，然后去医务室进行治疗。
洗眼器一般可以选用壁挂式洗眼器或便携式洗眼器。
3.面屏：面部防护用具用于保护脸部和喉部。为了防止可能的爆炸及实验产生的物体飞溅造成冲击伤害，可佩戴有机玻璃或聚碳酸酯材质的防护面罩或面屏。
身体防护人员进入实验室都必须穿防化服，其目的是为了防止身体的皮肤和衣着受到化学药品的污染。
防化服最基本的性能就是能够对一般化学药品耐腐蚀，如果是选用的可重复使用的防化服，在使用后还需用相应的溶剂冲洗保存，防止防化服表面附着的化学物质的二次伤害。
手部防护在实验室中为了防止手受到伤害，可根据需要选戴不同类型防护手套。
当接触腐蚀性物质，边缘尖锐的物体(如碎玻璃、木材、金属碎片)，过热或过冷的物质时均须戴手套。
化验室对易燃易爆物品应怎样存放
低沸点的化合物、需要低温保存的药品须按要求放入所需的环境（低温冰箱）；
避光保存的药品及其所配制的试剂，均应按要求用棕色容器（瓶）保存，或用深色纸包裹。
药品一律放入药品柜内，不得与配制的溶液混在一起放置；
液体药品放置矮柜。固体药品与液体药品分开放置；
酸碱不能混放，氧化剂和还原剂不能混放，如果混合会发生剧烈反应的试剂不能混放，防止可能因为倾倒，破碎等意外原因引发事故；
对于一些常温环境下存放的药品，一定要注意防潮，负责会发生固体结块现象！液体样品结块好像以前只遇到冰醋酸，放在温度高些的地方就能变成液态了；
北方的冬季有点冷，部分实验室的空调一般只制冷，不制热，有一些凝固点和常温偏差不大的试剂，会出现冬天凝固，夏天又变成液体的情况。还要注意的是，试剂瓶一般都是普通玻璃生产的，非常厚，温度变化太剧烈的话容易炸裂。比如，对怕冷怕冻的腐蚀性物品。如受冻结冰的冰醋酸，受冻聚合沉淀的甲醇等，库房温度应保持在15℃左右，冬季要保暖；
硫酸和盐酸都不好保存，虽然都是酸，硫酸应该跟甲酸、乙酸、盐酸分开放置；
甲酸、乙酸、盐酸有强挥发性，应通风良好，把酸雾及时排出；
硫酸具有强氧化性和强脱水性，应该单独放置。
好了，文章到这里就结束啦，如果本次分享的第五人格冷知识技巧和冷知识实验室第360期问题对您有所帮助，还望关注下本站哦！
